Manual de biologie Yarygin, partea A. Repararea prin restaurarea directă a structurii originale Repararea ADN-ului cu participarea helicazelor
ADN-ul este un polimer liniar care conține de la 70-80 la 109 mononucleotide, care sunt conectate prin legături fosfodiester covalente care apar între gruparea hidroxil pentoză a unei nucleotide și gruparea fosfat a următoarei nucleotide.
Datele analizei de difracție cu raze X au arătat că molecula de ADN a majorității organismelor vii, cu excepția unor fagi, este alcătuită din două lanțuri polinucleotidice, direcționate și orientate antiparalel astfel încât coloana vertebrală zahăr-fosfat să fie în exterior și bazele azotate sunt la interior. Bazele sunt dispuse în perechi una față de cealaltă și sunt legate prin legături de hidrogen. Împerecherea are loc numai între baze complementare (potrivite una cu cealaltă): o purină și una perimedină. Perechea A-T este conectată prin două, iar perechea G-C prin trei legături de hidrogen. Molecula de ADN are forma unui dublu helix, în care lanțurile de polinucleotide sunt răsucite în jurul unei axe centrale imaginare.
Helixul ADN-ului este caracterizat de o serie de parametri:
lățimea helixului este de aproximativ 2 nm;
pasul sau rotirea completă a helixului este de 3,4 nm și conține 10 perechi de nucleotide complementare.
ADN-ul are proprietăți unice: capacitatea de auto-duplicare (replicare) și capacitatea de auto-vindecare (reparare).
20 de proteine: recunoașterea secțiunilor modificate de ADN și îndepărtarea lor din lanț, restabilirea secvenței corecte de nucleotide și unirea fragmentului restaurat cu restul moleculei de ADN 5% din tot ARN-ul celular.
Replicare se desfășoară sub controlul unui număr de enzime și are loc în mai multe etape. Începe în anumite puncte ale moleculei de ADN. Enzimele speciale rup legăturile de hidrogen dintre legăturile de azot complementare, iar helixul se desfășoară. Lanțurile polinucleotidice ale moleculei părinte sunt menținute într-o stare nerăsucită și servesc ca șablon pentru sinteza noilor lanțuri.
Cu ajutorul enzimei ADN polimeraza, se asamblează lanțuri fiice din trifosfații dezoxiribonucleotidici (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) disponibili în mediu, complementari lanțurilor mamă. Replicarea are loc simultan pe ambele fire materne, dar cu viteze diferite și cu unele diferențe. Pe unul dintre lanțuri (conducătoare) asamblarea lanțului fiică are loc continuu, pe celălalt (întârziat) - fragmentar. Ulterior, fragmentele sintetizate sunt amestecate folosind enzima ADN ligaza. Ca rezultat, dintr-o moleculă de ADN se formează două molecule de ADN, fiecare având un lanț mamă și un lanț fiică. Moleculele sintetizate sunt copii exacte una ale celeilalte și ale moleculei originale de ADN. Această metodă de replicare a ADN-ului se numește semi-conservativă și asigură reproducerea corectă în moleculele fiice a informațiilor care au fost înregistrate în molecula mamă.
Reparații este capacitatea unei molecule de ADN de a „corecta” modificările care apar în lanțurile sale. Restaurarea moleculei originale de ADN implică cel puțin
Caracteristicile enumerate ale structurii chimice și proprietățile ADN-ului determină funcțiile pe care le îndeplinește. ADN-ul înregistrează, stochează, reproduce informația genetică și participă la procesele de implementare a acesteia între noile generații de celule și organisme.
ARN ribozomal (ARNr) Este sintetizat în principal în nucleol, în regiunea genelor ARNr, și este reprezentat de molecule de diferite greutăți moleculare care fac parte din subunitățile mari sau mici ale ribozomilor. ARNr reprezintă 85% din ARN total dintr-o celulă.
Transfer ARN (ARNt) reprezintă aproximativ 10% din ARN celular. Există mai mult de 40 de tipuri de ARNt. La implementarea informațiilor genetice, fiecare ARNt atașează un aminoacid specific și îl transportă la locul de asamblare a polipeptidei. La eucariote, ARNt-urile constau din 70-90 de nucleotide și au o structură în formă de trifoi.
Acizii ribonucleici – ARN – sunt reprezentați de molecule de diferite dimensiuni, structuri și funcții. Toate moleculele de ARN sunt copii ale anumitor secțiuni ale moleculei de ADN și, pe lângă diferențele deja menționate, sunt mai scurte decât aceasta și constau dintr-un singur lanț. Între secțiuni individuale ale unui lanț de ARN care sunt complementare între ele, sunt posibile împerecherea bazelor (A-U, G-C) și formarea de secțiuni elicoidale. Ca urmare, moleculele capătă o conformație specifică.
Matrice, sau informație, ARN(ARNm, ARNm) sintetizată în nucleu sub controlul enzimei ARN polimeraza, complementară secvențelor informative de ADN, transferă această informație la ribozomi, unde devine o matrice pentru sinteza unei molecule proteice. În funcție de cantitatea de informații copiate, molecula de ARNm poate avea lungimi diferite și reprezintă aproximativ 5% din tot ARN-ul celular.
Mecanismul de reparare se bazează pe prezența a două lanțuri complementare în molecula de ADN. Distorsiunea secvenței de nucleotide într-una dintre ele este detectată de enzime specifice. Apoi secțiunea corespunzătoare este îndepărtată și înlocuită cu una nouă, sintetizată pe a doua catenă complementară de ADN. Acest tip de reparație se numește reparație prin excizie, adică. cu „tăiere” (Fig. 15). Are loc înainte de următorul ciclu de replicare, motiv pentru care este numit și pre-replicativ.
Fig. 14. Schema procesului de corecție în timpul sintezei ADN:
I-includerea în lanțul ADN a unei nucleotide cu o formă alterată (tautomeră) de citoeină, care se asociază „ilegal” cu adenina; II - trecerea rapidă a citozinei la forma sa normală perturbă împerecherea acesteia cu adenina; capătul 3"-OH nepereche al lanțului sintetizat împiedică alungirea lui ulterioară sub acțiunea ADN polimerazei; III - ADN polimeraza îndepărtează nucleotida ilegală, în urma căreia capătul 3"-OH împerecheat cu matricea reapare; IV - ADN polimeraza continuă să extindă lanțul la capătul 3"-OH.
Restaurarea structurii originale a ADN-ului necesită participarea unui număr de enzime. Un punct important în declanșarea mecanismului de reparare este detectarea unei erori în structura ADN-ului. Adesea, astfel de erori apar în lanțul nou sintetizat în timpul procesului de replicare. Enzimele de reparare trebuie să detecteze acest lanț special. La multe specii de organisme vii, catena de ADN nou sintetizată diferă de cea maternă prin gradul de metilare a bazelor sale azotate, care rămâne în urma sintezei. În acest caz, lanțul nemetilat suferă reparații. Ruperele catenei de ADN pot fi recunoscute și de enzimele de reparare. În organismele superioare, unde sinteza ADN-ului nu are loc continuu, ci în repliconi separate, catena de ADN nou sintetizată are rupturi, ceea ce face posibilă recunoașterea acesteia. Restabilirea structurii ADN-ului atunci când bazele purinice ale unuia dintre lanțurile sale sunt pierdute implică detectarea defectului folosind enzima endonucleaza, care rupe legătura fosfoesterică la locul deteriorării lanțului. Apoi secțiunea modificată cu mai multe nucleotide adiacente este îndepărtată de enzima exonuclează, iar în locul ei, în conformitate cu ordinea bazelor lanțului complementar, se formează secvența corectă de nucleotide (Fig. 15).
Fig. 15. Schema de excizie, repararea ADN-ului pre-replicativ.
Când una dintre bazele din lanțul ADN-ului se modifică, aproximativ 20 de enzime ADN glicozilaze iau parte la restabilirea structurii originale. Ele recunosc în mod specific daunele cauzate de deaminare, alchilare și alte transformări structurale ale bazelor. Astfel de baze modificate sunt îndepărtate. Zonele lipsite de baze apar si sunt reparate, ca si la pierderea purinelor. Dacă structura normală nu este restabilită, de exemplu în cazul dezaminării bazelor azotate, unele perechi de baze complementare sunt înlocuite cu altele - perechea C-G poate fi înlocuită cu o pereche T-A etc. .
Formarea dimerilor de timină (T-T) în lanțurile de polinucleotide sub influența razelor UV necesită participarea enzimelor care nu recunosc bazele individuale modificate, ci o deteriorare mai extinsă a structurii ADN-ului. Procesul de reparare în acest caz este, de asemenea, asociat cu îndepărtarea regiunii care poartă dimerul și restabilirea secvenței normale de nucleotide prin sinteză pe catena de ADN complementară.
În cazul în care sistemul de reparare prin excizie nu corectează o modificare care a apărut într-o catenă de ADN, în timpul replicării această modificare este fixată și devine proprietatea ambelor catene de ADN. Acest lucru duce la înlocuirea unei perechi de nucleotide complementare cu alta sau la apariția unor rupturi (goluri) în lanțul nou sintetizat față de secțiunile modificate. Restaurarea structurii normale a ADN-ului poate avea loc și după replicare.
© Sharova N.P., Abramova E.B.
Deteriorarea și repararea ADN-ului
sau
„Pentru fiecare gaură există un petic”
N.P. Sharova, E.B
Natalia Petrovna Sharova, Doctor în Științe Biologice, cercetător principal la Institutul de Biologie a Dezvoltării N.K. Koltsov al Academiei Ruse de Științe.
Elena Borisovna Abramova, Candidat la Științe Biologice, cercetător principal la același institut.
Programul genetic al oricărei viețuitoare înregistrate în ADN - de la cel mai simplu unicelular la cel multicelular foarte organizat - este păstrat într-o serie de descendenți datorită reproducerii exacte a secvenței de nucleotide în fiecare generație. Dar dacă se produce deteriorarea moleculei ereditare principale, iar acest lucru se întâmplă chiar și spontan, modificările structurii acesteia pot duce nu numai la diferite patologii ale țesuturilor sau organelor, ci și la transmiterea mutației către descendenți. Și, în mod surprinzător, ADN-ul este singura macromoleculă celulară care poate corecta deteriorarea propriei sale structuri. Codifică chiar și informații despre mecanismele acelor procese care efectuează astfel de reparații (într-un mediu strict științific sunt numite procese de reparație). Este „repararea” ADN-ului care oferă organismului o marjă de siguranță.
Restaurarea structurii ADN-ului este deosebit de importantă în timpul formării celulelor de reproducere (germeni) și în dezvoltarea embrionară: în timpul sintezei active a noilor lanțuri, riscul de apariție și repetare a erorilor crește de multe ori. Molecula ereditară trebuie să se vindece foarte repede, iar celulele embrionare care se divide „știu” cum să facă acest lucru. Diferite leziuni ale ADN-ului sunt eliminate de-a lungul vieții organismului. Să începem povestea cu tipurile de daune cunoscute în prezent, pentru a lua în considerare apoi mecanismele de reparare, deoarece natura defecțiunii determină modul în care va fi eliminată.
Ce poate merge rău în ADN?
Defalcările sunt posibile în oricare dintre componentele care formează ADN - atât în baze azotate, cât și în coloana vertebrală zahăr-fosfat, atât în timpul copierii (replicării), cât și în timpul citirii (transcripției) informațiilor pentru sinteza ulterioară a proteinelor celulare.
Apurinizarea uneia sau alteia nucleotide și dezaminarea bazelor apar adesea. În primul caz, legăturile glicozidice dintre purină (adenină sau guanină) și dezoxiriboză sunt rupte, drept urmare aceste baze sunt scindate din lanțul ADN (locul în care a avut loc un astfel de eveniment se numește situs AP). Al doilea caz - dezaminarea - duce la formarea unor compuși neobișnuiți pentru structura ADN-ului: în loc de citozină, apar adenina sau guanina, uracilul, hipoxantina sau, respectiv, xantina. Ambele procese sunt spontane. Pe parcursul unei zile într-o celulă umană, apurinizarea se repetă de 5-10 mii de ori, iar frecvența dezaminării este de aproximativ 100 de evenimente per genom complet.
Acțiunea iradierii ultraviolete duce la saturarea dublelor legături ale bazelor pirimidinice și la formarea de dimeri din două pirimidine vecine din aceeași catenă de ADN. Radiațiile ionizante pot provoca mai multe daune: ruperea inelului purinic, fragmentarea bazei, oxidarea locului de apurină și rupturi simple și duble (aceasta este de fapt ruperea cromozomilor - principala cauză a efectelor letale ale radiațiilor ionizante). Unii agenți chimici sunt capabili de reticulare a catenelor de ADN. Speciile reactive de oxigen (OH·, O2·–, H2O2, peroxizii lipidici etc.), generate constant în procesele metabolice, dăunează atât bazelor, cât și dezoxiribozei, ceea ce favorizează formarea de noi legături covalente. Guaninele vecine (GG) sunt deosebit de susceptibile la acțiunea oxidativă. Acestea sunt literalmente „punctele fierbinți” ale unui astfel de proces, iar rezultatul său final este un derivat modificat de guanozină. Legăturile zahăr-fosfat sunt distruse în cazurile în care ambele catene de ADN sunt lipsite de purine în locuri opuse sau în apropiere are loc fragmentarea dezoxiribozei. Apoi ambele catene de ADN se rup simultan. Sursa defectelor structurale poate fi și un proces natural - replicare, dacă în lanțurile complementare apar nucleotide nepereche.
|
Celula este capabilă să elimine daunele enumerate, în ciuda diferențelor lor, și să restabilească structura ADN-ului. Este destul de clar că acest lucru necesită mecanisme speciale. Și deși în anumite particularități diferă unele de altele și sunt foarte complexe, totuși se supun principiilor generale. În primul rând, este identificat tipul de defecțiune care a apărut. Acest lucru este realizat de o proteină sau mai multe (apoi se combină într-un complex la locul defectului). Zona deteriorată este apoi excizată prin reacții enzimatice, după care ADN polimeraza sintetizează bucata corectă de ADN. Reparația este finalizată prin cusarea împreună a fragmentelor individuale ale lanțului cu ADN ligază. Aceasta este schema generală, dar fiecare tip de reparație este efectuat de propriile proteine și enzime care îi determină individualitatea. Nu este adevărat că această schemă seamănă cu obișnuitul petic al găurilor în haine?
Foarfece moleculare și plasturi
Majoritatea defectelor structurale ale ADN-ului sunt eliminate prin excizie (expertii numesc acest tip de excizie reparatorie; in engleza. repararea exciziei), care este realizat de enzimele nucleaze. Baza defectă este îndepărtată singură sau împreună cu împrejurimile sale - secțiuni ale lanțului de 2-10 nucleotide. În acest fel, bazele modificate și deteriorate, locurile apurinice și locurile cu rupturi monocatenare sunt excizate. (Acest tip se numește reparație prin excizie de bază; repararea exciziei bazei, BER.) În cazul unor disfuncționalități mai mari - apariția dimerilor de pirimidină sau a altor formațiuni volumetrice în ADN care perturbă structura helixului - foarfecele celulare taie partea deteriorată ca parte a unei piese lungi de 30 de nucleotide. (Aceasta este deja reparație prin excizie de nucleotide, repararea exciziei nucleotidelor, NER.)
Dimensiunea piesei tăiate și, prin urmare, a plasturelui, va depinde de deteriorarea în sine și de raportul dintre ADN polimerazele prezente în celulă. Aceste enzime umple golurile lăsate prin tăierea secțiunii anormale, folosind ca șablon un fragment din catena de ADN opusă. ADN-polimerazele (mai mult de 15 dintre ele sunt cunoscute la eucariote) diferă într-un număr de caracteristici, inclusiv numărul de nucleotide pe care reușesc să le integreze în lanțul în creștere într-un act de legare la un duplex de ADN. Polimerazele b și l adaugă doar o singură nucleotidă, adică. aplica un plasture mic ( plasture scurte calea BER, după cum spun experții). Alte două ADN polimeraze - d și e - sunt capabile să creeze o inserție mare, dar pentru aceasta au nevoie de un ajutor special - proteina PCNA ( antigenul nuclear celular în proliferare). Prima enzimă este dependentă în special de ea - fără un asistent, „cade” din ADN, inserând doar o singură nucleotidă, iar dacă PCNA deține polimeraza d pe ea, atunci sinteza continuă până când fragmentul atinge lungimea necesară. Dacă unei celule îi lipsește una sau alta ADN polimerază, repararea poate trece de la o cale la alta, de exemplu. de la un petic mic la unul mare ( plasture lung calea BER). Liniile celulare de fibroblaste embrionare de șoarece refac structura normală la locul apurinizării în principal printr-un mic plasture (în 80% din cazuri), iar dacă gena ADN polimeraza b este deteriorată în celule, repararea are loc exclusiv prin aplicarea unui plasture mare. . Apropo, modul în care o celulă plastează găurile depinde și de cât de multă proteină PCNA conține.
Probleme minore. Dacă o bază este schimbată în ADN, aceasta este recunoscută, iar apoi N-glicozilazele o taie, lăsând deoxiriboză fosfat în lanț (ca în apurinizare). Coloana vertebrală a fosfatului de zahăr este apoi tăiată de o endonuclează AP (clasa II) pe partea 5 a acestui intermediar asemănător AP. Celula o poate elimina complet în două moduri ( plasture scurte sau plasture lung BER): prin tăierea reziduului de deoxiriboză fosfat singur sau împreună cu două până la zece nucleotide din jur. Plasturele este sintetizat în funcție de dimensiunea găurii formate. Golul de o nucleotidă este umplut de ADN polimerază b. Este o problemă diferită dacă situl AP care apare în ADN suferă și el oxidare sau reducere. O astfel de anomalie structurală, împreună cu nucleotidele din jur, este tăiată de o altă enzimă - nucleaza FEN1 - iar golul rezultat este umplut de ADN polimeraze d sau e, care lucrează numai cu un asistent - proteina PCNA. Uneori, golurile scurte (până la 5-6 nucleotide lungime) sunt umplute de ADN polimeraze b sau l. Ei nu au nevoie de un asistent, deoarece ei înșiși se pot „ancora” temporar la capătul liber de 5º al lanțului adiacent golului și să rămână pe ADN pentru o perioadă de timp pentru a resintetiza secțiunea excizată.
Am studiat repararea peștilor teleostei în timpul dezvoltării lor embrionare de câțiva ani. În această perioadă de ontogeneză, noi lanțuri de ADN sunt sintetizate activ și, prin urmare, riscul de apariție și repetare a erorilor crește de multe ori. Pentru a preveni acest lucru, molecula ereditară trebuie să se vindece foarte repede. Am emis mai întâi ipoteza că celulele embrionare care se divide trebuie să aibă mai multe moduri echivalente de a repara aceleași daune. În acest fel, structura ADN-ului din toate zonele deteriorate ar fi restabilită simultan, iar procesul ar fi finalizat cu succes chiar dacă alte căi de reparare sunt suprimate din orice motiv. Dar, în loc să confirmăm experimental presupunerea noastră, am descoperit un tip necunoscut anterior de reparare a ADN-ului. Lucrând cu embrioni și ouă de loach (pește osos), am întâlnit în mod neașteptat construcția independentă de goluri destul de mari (până la 10-13 nucleotide) de către ADN polimeraza d - aceeași enzimă care, așa cum tocmai am menționat, nu se poate descurca fără asistentul PCNA. Dar în perioada embrionară a loachului, polimeraza d nu avea nevoie de un asistent. S-a dovedit că această enzimă este capabilă să se lege simultan de ambele capete ale ADN-ului rupt și să rămână ferm acolo până când „peticește gaura” complet. Acest mecanism de reparare a ADN-ului în divizarea activă a celulelor embrionare a fost necunoscut anterior. Între timp, este foarte important, mai ales având în vedere că un plasture mare elimină majoritatea defectelor apărute în ADN. Metoda de reparare pe care am descoperit-o este unică prin faptul că funcționează în condiții extreme: fără o proteină auxiliară deloc sau cu o cantitate mică din aceasta și, de asemenea, în cazul în care celulei îi lipsesc alte ADN polimeraze care se descurcă fără PCNA.
Nu o gaură, ci un puf. Razele ultraviolete provoacă reticulare covalentă a pirimidinelor adiacente (de exemplu, timinele) în molecula de ADN. Șapte proteine, produse ale genelor familiei XP (XPA-XPG), sunt implicate în recunoașterea și excizia dimerilor de ciclobutan rezultați. La om, mutațiile în cel puțin una dintre ele pot duce la dezvoltarea unei boli ereditare - xeroderma pigmentosum ( xeroderma pigmentară, XP), care se manifestă în primii ani de viață ai unui copil. Pe zonele pielii care nu sunt protejate de razele soarelui apar pete pigmentare și în cele din urmă se poate dezvolta cancer de piele.
De ce aveți nevoie de atâtea proteine și cum funcționează ele? Fiecare dintre ele joacă un rol strict definit. Proteina XPA recunoaște dimerul de pirimidină din ADN și se leagă de alți membri ai familiei. HRB și XPD fac parte dintr-un complex proteic complex, factorul de transcripție IIH (TFIIH), care desfășoară ADN-ul la locul care urmează să fie excizat. O altă proteină - XPC - deține acest complex pe secțiunea ADN deteriorată, iar ultimele două (se numesc nucleaze de excizie) - XPF și XPG - funcționează ca o foarfecă. Prima nuclează taie legătura a 24-a fosfodiester pe partea 5ў a dimerului, iar a doua taie legătura a 5-a pe partea 3ў. Ca rezultat al acțiunii lor combinate, se formează un gol de aproximativ 30 de nucleotide.
Ei umplu un gol atât de mare cu ADN polimerază d sau e, dar au nevoie de un asistent PCNA. Mai mult, pentru ca prima enzimă să funcționeze, este necesară o altă proteină - factorul replicativ C (RFC). În prezența ATP, acesta se leagă de capătul catenei de ADN care se apropie de gol din partea 5, apoi PCNA se unește și se formează un complex ternar instabil. După hidroliza ATP, conformația factorului de replicare se modifică astfel încât să țină PCNA ca cu degetele deschise. Acest asistent în sine, datorită deschiderii temporare a formei sale de inel, este atașat de duplexul ADN. ADN polimeraza d se alătură complexului stabil rezultat, care umple golul mare. Un complex care implică ADN polimeraza e funcționează într-un mod similar. După cum puteți vedea, există mulți participanți la eliminarea daunelor volumetrice, iar procesul în sine este destul de complex.
Dacă genele sunt transcrise în mod activ în celule (adică ARN-ul mesager este sintetizat), restaurarea prin excizia nucleotidelor decurge mult mai rapid datorită includerii a încă două proteine în proces - CSA și CSB. La om, mutațiile în genele acestor proteine provoacă o boală ereditară - sindromul Cockayne ( sindromul Cockayne, CS), în care creșterea încetinește, fotosensibilitatea crește, apar cataractă, carii dentare și dermatoze. Dacă în timpul transcripției ARN polimeraza II care o realizează întâmpină leziuni în ADN, aceasta se leagă de proteinele CSA și CSB. Apoi, livrarea rapidă a enzimelor de reparare la locul defalcării este garantată, acestea vor repara gaura, după care transcrierea poate fi finalizată.
Erori de țesut. Erorile de replicare și recombinarea (schimbul de secțiuni) între alele pot duce la apariția nucleotidelor nepereche în lanțul ADN. Pentru a elimina astfel de probleme, există un tip special de reparație - repararea nepotrivirii (MMR). Cel mai simplu mod de a le corecta este eliminarea imediată a nucleotidei introduse incorect folosind aceleași ADN polimeraze d sau e (deși cu activitate exonuclează suplimentară). O opțiune mai complexă este realizată prin acțiunea comună a enzimelor care sunt capabile să taie zona deteriorată (enzime de reparare prin excizie) și un grup de proteine suplimentare. Ei recunosc nucleotide singulare nepereche sau bucle lungi de până la patru nucleotide. (Mutațiile în genele acestor proteine la oameni provoacă o predispoziție la cancer.) Odată detectat defectul, nucleazele îl îndepărtează, împreună cu 50-500 de nucleotide pe fiecare parte. Uriașul gol este umplut de aceleași polimeraze care sunt dependente de PCNA și, prin urmare, sunt capabile să sintetizeze fragmente lungi de ADN.
Regulament. PCNA (a fost deja discutat ca asistent în reparații) și proteina 53 (p53) sunt principalii regulatori ai celulei, responsabili de soarta acesteia. Prima proteină, PCNA, este implicată în replicare, a doua, p53, în transcripție. Ce fac aceste proteine dacă se produce daune în timpul copierii ADN, care trebuie reparată de ADN polimeraza d? Proteina 53 stimulează sinteza proteinei 21, care inhibă copierea ADN-ului și trecerea ciclului celular. În timpul în care replicarea se oprește, celula reușește să scape de defect. Cum poate fi acest lucru, deoarece replicarea și repararea sunt întotdeauna sinteza ADN, care implică aceeași proteină PCNA? Replicarea se oprește din cauza faptului că p21 se leagă de PCNA, ceea ce înseamnă că nu va fi suficient pentru reparare. Dar nu: un exces de PCNA este creat în zona daunelor și este eliminat cu succes.
Unii oameni de știință cred că, cu un conținut crescut de p21, resinteza este efectuată nu de polimeraza d, ci de polimeraza b, care nu este sensibilă la acțiunea p21. Pe baza rezultatelor noastre, presupunem că nu există nicio modificare a enzimelor, ci pur și simplu ADN polimeraza d trece de la umplerea golului dependentă de PCNA la sinteza ADN-ului independent de această proteină.
Când structura ADN-ului este restabilită, o serie de proteine și enzime reglatoare implicate în reparare sunt supuse hidrolizei, care este efectuată de proteazomul 26S. Astfel de proteine includ, de exemplu, proteina XPC. În plus, proteazomul însuși sau complexul de reglare 19S care face parte din acesta poate juca rolul de chaperone moleculare, facilitând dobândirea conformației dorite prin proteine de reparare. În acest caz, proteazomul stimulează corectarea ADN-ului.
Prin pauze
Rupele de la capăt la capăt ale moleculei de ADN sunt rezultatul radiațiilor ionizante, oxidării sau deteriorării mecanice. Aceleași defalcări sunt posibile în cazurile în care, în timpul replicării, are loc o rupere a unei catene de-a lungul traseului ADN polimerazelor. Dar rupturile dublu-catenari pot fi, de asemenea, produse intermediare ale proceselor biologice normale (de exemplu, recombinarea în celulele limfoide în curs de dezvoltare). Dacă o celulă nu poate repara rupturi de la capăt la capăt, aceasta va duce la destabilizarea genomului, mutații și apariția tumorilor canceroase și, uneori, la declanșarea apoptozei (moartea celulară programată). La eucariote, există două modalități principale de reparare a rupurilor dublu-catenar: recombinarea omoloagă (repararea recombinației) și unirea capetelor neomolog.
 |
 |
Secvența de reconstrucție a ADN-ului în care ambele catene sunt rupte prin recombinare omoloagă ( stânga) și îmbinarea capetelor neomoloage.Dacă există un duplex ADN omolog a cărui secvență este complementară cu cel puțin un capăt rupt, repararea recombinațională este posibilă. În drojdie Saccharomyces cerevisiae aceasta este varianta principală și depinde de proteina RAD52, iar în cazul mutațiilor genei Rad52 se unesc capete neomolog, adică. a doua variantă de reparare este activată. La mamifere, dimpotrivă, a doua metodă funcționează în principal, iar la Drosophila ambele moduri sunt echivalente. Indiferent de opțiunea de reparare, fragmentele de lungimi diferite sunt pur și simplu tăiate; Desigur, în acest caz, structura primară a ADN-ului este perturbată și informațiile codificate în zonele îndepărtate se pierd. Dar, deoarece rupturile dublu-catenari sunt relativ rare, probabil că este mai bine ca celula să facă astfel de sacrificii decât să lase ADN-ul rupt.
Prima metodă de reparare a ADN-ului este caracteristică drojdiei ( Saccharomyces cerevisiae), al doilea - pentru mamifere, inclusiv oameni.
Explicații în text.
Schimb omolog. Proteina RAD52, de care depinde repararea recombinațională în drojdie, se leagă, așa cum tocmai am menționat, la capetele proeminente ale catenelor de ADN rupte, protejându-le astfel de acțiunea exonucleazelor. RAD52 stimulează apoi proteina RAD51 să se atașeze de locurile în care se afla. După aceasta, un capăt sau ambele sunt introduse într-un duplex ADN omolog și are loc recombinarea. Părțile de ADN care ies din „gaura” sunt tăiate, iar golul rezultat este construit imediat din părți opuse, de exemplu. sinteza fragmentelor se deplasează unul spre celălalt. În celulele de drojdie S.cerevisiae este realizat de polimerazele d și e, care necesită PCNA și factor de replicare (RFC) pentru a se ține de capătul rupt al ADN-ului și pentru a efectua sinteza. Adevărat, ADN-polimeraza a este, de asemenea, implicată în închiderea decalajului, singura dintre multele polimeraze capabile să inițieze sinteza ADN-ului la bifurcația de replicare - unde firele încep să se desfacă. Având în vedere participarea acestei enzime la repararea rupurilor ADN-ului de la capăt la capăt, A. Holmes și J. Haber au propus un model conform căruia introducerea unuia dintre capete rupte într-un duplex ADN omolog creează o bifurcătură de replicare neobișnuită, unde se sintetizează lanțuri. Replicarea se termină când celălalt capăt ajunge la pauză. Secțiunea de capăt „atârnată” a celei de-a doua catene care se dovedește a fi redundantă este îndepărtată de nuclează.
Recombinarea omologa este un alt mod de a repara erorile. Capetele rupte ale ADN-ului sunt tăiate bucată cu bucată de o exonuclează specifică în ambele direcții de la rupere până când sunt expuse secvențele complementare. Aceasta este urmată de recoacere (împerechere) regiunilor complementare și tăierea cozilor ADN neomolog „atârnate”. Această cale de reparare depinde și de proteina RAD52.
Îmbinarea capetelor neomolog. Repararea ADN-ului rupt în ambele catene în acest fel este asigurată de un întreg set de proteine. Este o proteină Ku și un complex format din ADN ligaza IV și produsul genei XRCC4. Toate sunt conservate printre eucariote, inclusiv drojdii și mamifere. În ciuda faptului că în timpul reparației, capetele sparte sunt îmbinate direct, fără a utiliza o matrice pentru sinteză, procesul trebuie să fie cât mai atent și precis posibil. Pentru a îndeplini această cerință, se utilizează proteina Ku, care este un heterodimer al subunităților Ku70 și Ku80 (greutate moleculară 70 și, respectiv, 80 kDa). Recent, a fost studiată structura cristalină a heterodimerului uman, precum și structura complexului său cu un fragment de ADN de 55 de nucleotide. S-a dovedit că heterodimerul Ku înfășoară un inel în jurul duplexului ADN, dar nu intră în contact cu bazele ADN, ci formează mai multe legături cu coloana vertebrală zahăr-fosfat și este ajustat spațial la spirele helixului ADN, astfel încât acestea să fie situate în inelul proteic într-un mod strict definit. Această configurație a complexului Ku și ADN este aparent necesară pentru a menține structura capetelor proeminente, care este potrivită pentru etapele ulterioare de reparare.
Și sunt mai mulți dintre ei. Mai întâi, un heterodimer este „pus” pe capetele atârnate ale ADN-ului, apoi se leagă unul de celălalt, formând o punte. Acesta este motivul pentru care ceilalți participanți se alătură și își îndeplinesc funcțiile: ADN polimeraza umple golurile formate ca urmare a unirii capetelor neomoloage ale ADN-ului; nucleaza taie capetele proeminente dacă sunt prea lungi; Ligaza IV unește fragmentele reduse împreună. La unele eucariote, a fost descoperită ADN polimeraza m, care aparent umple golurile din ADN.
Când lanțurile sunt cusute
Unii agenți chimici, cum ar fi medicamentele împotriva cancerului (cisplatină, mitomicina, psoralen), provoacă formarea de legături încrucișate ADN între catenele. Eucariotele sunt capabile să elimine astfel de probleme, dar mecanismele de reparare nu sunt suficient de clare. Se știe că în drojdia înmugurire S.cerevisiae depinde de sistemele enzimatice care asigură, de exemplu, îndepărtarea dimerilor de timină (după cum sa menționat deja) și de recombinare. Același sistem enzimatic de șapte proteine (XPA-XPG) funcționează, așa cum am observat deja, în corectarea ADN-ului uman cu lanțuri reticulate. Dar lucrurile devin și mai complicate. Să ne amintim: una dintre proteine, XPF, taie catena de ADN de pe partea de 5° a leziunii la o distanță de 20(±5) nucleotide, cealaltă, XPG, taie catena de ADN de pe partea de 3° 6(±5). 3) nucleotide din dimer. Cu toate acestea, în ADN-ul uman, aceste endonucleaze taie 22-28 de nucleotide într-o catenă de ADN și numai pe o parte a reticularii, fără a afecta defectul în sine. De ce nucleaza umană nu taie lanțul în mod obișnuit, pe ambele părți ale daunei? Prin urmare, cercetătorii cred că înainte de a tăia dublu helix trebuie să fie deztors (enzima helicază este folosită pentru aceasta). Dar poate desface duplexul nu în vecinătatea legăturii încrucișate, ci la o distanță de acesta - la o distanță de 20 (± 5) nucleotide din partea 5. Zona nețesută capătă aspectul unei bule. Apoi o endonuclează, XPG, rupe lanțul în locul său corespunzător (adică, mai aproape de defect), iar cealaltă, XPF, rupe aproximativ a 27-a legătură fosfodiester de pe partea a 5-a a reticularii. Dar aceasta este doar prima etapă a reparării ADN-ului cu legături încrucișate între catenele.
Ce urmeaza? Conform unuia dintre modelele ipotetice dezvoltate, ceea ce urmează este recombinarea unui duplex ADN omolog. Decalajul mare de 22-28 de nucleotide este cel care inițiază acest proces. Dar în stadiul de transfer al catenei este blocat, după care o endonuclează specifică taie aceeași catenă de cealaltă parte a reticularii. Intermediarul nou format este recunoscut de componentele „foarfecelor moleculare” (sistem de reparare a exciziei), iar oa doua rundă de tăiere se efectuează, acum dublă, în a doua șuviță. Ca rezultat, oligomerii reticulați sunt eliberați și recombinarea este finalizată. Astfel, un lanț este reparat prin recombinare. Gaura din a doua catenă este umplută de ADN polimerază folosind prima ca șablon.
Este interesant de observat că o proteină care conține helicază și domenii ADN polimerază a fost descoperită recent la eucariotele superioare. Mutațiile genei sale cresc în mod semnificativ sensibilitatea organismului la agenții care provoacă legături încrucișate între firele de ADN. Și deoarece atât activitățile helicazei, cât și cele polimerazei sunt necesare în anumite etape de reparare a ADN-ului reticulat datorită recombinării, s-a ajuns la concluzia că această proteină este implicată într-un astfel de proces de reparare. Ulterior, proteina unică a fost numită ADN polimerază q.
| Schemă ipotetică pentru eliminarea legăturilor încrucișate ADN intercatenare. Explicații în text. |
Dacă deteriorarea nu este înlăturată
Deci, deteriorarea ADN-ului la eucariote vine sub o varietate de forme. Și deși există mecanisme eficiente pentru eliminarea unor astfel de defecte, uneori celula nu este capabilă să le elimine pe toate dintr-un motiv sau altul. În acest caz, replicarea ADN-ului se oprește în zonele deteriorate ale matricei. Până de curând, nu era clar cum este copiat ADN-ul în zonele deteriorate care nu pot fi reparate prin metode cunoscute. Acest lucru a devenit clar abia recent.
În ultimii câțiva ani, a fost descoperit un nou grup de ADN polimeraze - z, h, k, i, m, REV1 - care este tocmai conceput pentru a scăpa de astfel de daune. Polimerazele z, h și m efectuează resinteza ADN-ului dacă dimerii de ciclobutan între timinele vecine sunt nerezolvați; ultimele două enzime, precum și polimerazele k și REV1, menținând în același timp situsurile guaninei oxidate și apurinice, iar polimeraza REV1, de asemenea, formează cu succes situsuri cu O(6)-metilguanină. Interesant este că z-polimeraza „lucrează în tandem” cu polimeraza h sau REV1, extinzând secțiunea ADN deteriorată pe care au traversat-o de mai multe nucleotide.
În timpul replicării ADN-ului, polimerazele enumerate introduc uneori nucleotidele corecte împotriva zonelor deteriorate ale șablonului, în timp ce structura ADN-ului nu este perturbată. În unele cazuri, sunt incluse nucleotide eronate și apoi apar mutații. În prezent, un nou grup de ADN polimeraze primește o atenție deosebită, deoarece celulele au nevoie de un aparat enzimatic capabil să sintetizeze ADN-ul în situațiile în care repararea prin excizie este ineficientă sau imposibilă, iar riscul acumulării de mutații este justificat.
* * * Inițial, un mecanism conceput pentru a repara deteriorarea ADN-ului a apărut aparent odată cu celula. Pe măsură ce organismele au evoluat, a devenit mai complex și au apărut noi variante. Cât de important este acest mecanism poate fi judecat după faptul că câteva zeci de gene sunt implicate în eliminarea daunelor ADN-ului, iar celula își cheltuiește majoritatea resurselor pentru producerea de enzime de reparare. Fiabilitatea conservării secvențelor de nucleotide ADN la eucariotele superioare este foarte mare: de exemplu, în genomul unui mamifer, numărând aproximativ 3 miliarde de perechi de baze, doar 10-20 de baze sunt înlocuite în celulele tractului germinal pe an, dar mii de nucleotide sunt deteriorate. Perioada embrionară necesită o fiabilitate specială: atunci când celulele se divid activ, este necesar să se repare cât mai repede posibil numeroase defecțiuni și să se păstreze intactă informația genetică. Sistemele prin care se restabilește structura naturală a ADN-ului nu numai că protejează genomul de tot felul de daune, ci servesc și procesele genetice din celulă. Și dacă din orice motiv procesul de reparare în sine este întrerupt, acest lucru poate duce la probleme grave pentru celule și întregul organism. Acest lucru are ca rezultat o predispoziție crescută la anumite boli, inclusiv cancer, și boli ereditare severe. Cunoașterea mecanismelor care conduc la diferite boli este extrem de necesară pentru medicina practică pentru a facilita căutarea modalităților de tratare a acestora. Și, desigur, cunoașterea elimină o altă lacună în înțelegerea lumii, chiar dacă este moleculară.
Lucrarea a fost susținută de Fundația Rusă pentru Cercetare de bază. Proiecte 00-04-49183, 03-04-49127.
Literatură
1. Sharova N.P., Abramova E.B., Dmitrieva S.B., et al.// FEBS Lett. 2000. V.486. P.14-18. 2. Sancar A.// Ann. Rev. Biochim. 1996.V.65. P.43-81. 3.Wood R.D., Shivji M.K.K.// Carcinogeneza. 1997.V.18. P.605-610. 4. Abramova E.B., Sharova N.P., Karpov V.L.// Mol. biologie. 2002. T.36. P.761-776. 5. Sekelsky J.J., Burtis K.C., Hawley R.S.// Genetica. 1998. V.148. P.1587-1598. 6. Holmes A.M. și Haber J.E.// Celulă. 1999.V.96. P.415-424. 7. Haber J.E.// Trends Genet. 2000. V.16. P.259-264. 8. Kohn K.W.// Cancer Res. 1996.V.56. P.5533-5546. 9. Besshno T., Mu D. și Sancar A.// Mol. Celulă. Biol. 1997. V.17. Str.6822-6830. 10.Burgers P.M.J., Koonin E.V., Bruford E., et al.// J. Biol. Chim. 2001. V.276. P.43487-43490.
Pentru a menține principalele caracteristici ale unei celule sau organism pe tot parcursul vieții sale, precum și pe parcursul unui număr de generații, materialul ereditar trebuie să fie rezistent la influențele externe sau trebuie să existe mecanisme de corectare a modificărilor care apar în el. În natura vie, se folosesc ambii factori. Al treilea factor este acuratețea copierii secvențelor de nucleotide ale ADN-ului matern în timpul replicării sale.
Orez. 3. 13. Proteine implicate în procesul de replicare a ADN-ului
ADN helicaza derulează dubla helix ADN, separându-i lanțurile polinucleotidice; proteinele destabilizatoare îndreptează o secțiune a lanțului ADN; ADN-topoizomeraza rupe legătura fosfodiesterică dintr-unul dintre lanțurile de policarbonat ale ADN-ului, ameliorând tensiunea cauzată de desfășurarea helixului și divergența lanțurilor din furca de replicare; ARN primaza sintetizează primeri ARN pentru catena fiică și pentru fiecare fragment Okazaki; ADN polimeraza realizează sinteza continuă a catenei conducătoare și sinteza fragmentelor Okazaki ale catenei rămase; ADN ligaza unește fragmentele Okazaki împreună după îndepărtarea primerului ARN
În ceea ce privește reactivitatea, moleculele de ADN aparțin categoriei de substanțe inerte din punct de vedere chimic. Se știe că nu numai ADN-ul, ci și ARN-ul (unii virusuri) pot juca rolul unei substanțe a eredității. Se crede că alegerea în favoarea ADN-ului se datorează reactivității sale mai mici în comparație cu ARN.
Mecanismul de replicare discutat mai sus este caracterizat de o acuratețe extrem de mare în reproducerea structurii ADN. Când ADN-ul este dublat, apar erori cu o frecvență medie de 1·10 -6 perechi de baze complementare.
În menținerea acurateței de replicare ridicate, un rol important îi revine în primul rând enzimei ADN polimeraza. Această enzimă selectează nucleotidele necesare dintre trifosfații nucleozidici (ATP, TTP, GTP, CTP) prezenți în seva nucleară, le atașează cu precizie de catena de ADN șablon și le încorporează în catena fiică în creștere (vezi Fig. 3.10). Frecvența de includere a nucleotidelor incorecte în acest stadiu este de 1·10 -5 perechi de baze.
Astfel de erori în funcționarea ADN polimerazei sunt asociate cu apariția unor forme modificate de baze azotate care formează perechi „ilegale” cu bazele lanțului mamă. De exemplu, o formă alterată de citozină, în loc de guanină, se leagă de hidrogen de adenină. Ca rezultat, o nucleotidă eronată este inclusă în lanțul de ADN în creștere. Tranziția rapidă a formei modificate a unei astfel de baze la cea obișnuită întrerupe legarea acesteia la matrice și apare un capăt nepereche de 3"-OH al lanțului de ADN în creștere. În această situație, mecanism de autocorecție realizat de ADN polimeraza (sau o enzimă strâns legată de aceasta - editarea endonucleazei). Autocorecția constă în scindarea unei nucleotide care este inclusă în mod eronat în lanțul ADN și nu este asociată cu șablonul (Fig. 3.14). Consecința autocorectării este o scădere a ratei de eroare de 10 ori (de la 10 -5 la 10 -6).
În ciuda eficacității auto-corecției, erorile sunt detectate în timpul replicării după duplicarea ADN-ului. Acest lucru este observat mai ales atunci când concentrația a patru nucleozide trifosfați în substratul înconjurător este perturbată. O parte semnificativă a modificărilor are loc și în moleculele de ADN ca urmare a proceselor care apar spontan asociate cu pierderea bazelor purinice - adenina și guanina (apurinizare) - sau dezaminarea citozinei, care este transformată în uracil. Frecvența modificărilor recente ajunge la 100 per 1 genom/zi.
Bazele conținute în ADN pot fi modificate de compuși reactivi care perturbă împerecherea lor normală, precum și de radiațiile ultraviolete, care pot provoca formarea unei legături covalente între două resturi de timină adiacente din ADN (dimeri de timină). Aceste modificări în următorul ciclu de replicare ar trebui să conducă fie la pierderea perechilor de baze din ADN-ul fiică, fie la înlocuirea unor perechi cu altele. Aceste modificări însoțesc într-adevăr fiecare ciclu de replicare a ADN-ului, dar frecvența lor este mult mai mică decât ar trebui să fie. Acest lucru se explică prin faptul că majoritatea modificărilor de acest fel sunt eliminate datorită acțiunii mecanismului reparatii(restaurarea moleculară) a secvenței originale de nucleotide ADN.
Mecanismul de reparare se bazează pe prezența a două lanțuri complementare în molecula de ADN. Distorsiunea secvenței de nucleotide într-una dintre ele este detectată de enzime specifice. Apoi secțiunea corespunzătoare este îndepărtată și înlocuită cu una nouă, sintetizată pe a doua catenă complementară de ADN. Acest tip de reparație se numește excizie, acestea. cu „tăiere” (Fig. 3.15). Se efectuează înainte de următorul ciclu de replicare, motiv pentru care se mai numește pre-replicativ.
Orez. 3.14. Schema procesului de corecție în timpul sintezei ADN:
eu-includerea în lanțul ADN a unei nucleotide cu o formă alterată (tautomeră) de citoeină, care se asociază „ilegal” cu adenina; II- trecerea rapidă a citozinei la forma sa normală perturbă împerecherea acesteia cu adenina; capătul 3"-OH nepereche al lanțului sintetizat previne alungirea ulterioară a acestuia sub acțiunea ADN polimerazei; III - ADN polimeraza elimină nucleotida ilegală, rezultând reapariția celei asociate cu șablonul 3 "- OH-capăt; IV- ADN polimeraza continuă să extindă lanțul la capătul 3"-OH
Restaurarea structurii originale a ADN-ului necesită participarea unui număr de enzime. Un punct important în declanșarea mecanismului de reparare este detectarea unei erori în structura ADN-ului. Adesea, astfel de erori apar în lanțul nou sintetizat în timpul procesului de replicare. Enzimele de reparare trebuie să detecteze acest lanț special. La multe specii de organisme vii, catena de ADN nou sintetizată diferă de cea maternă prin gradul de metilare a bazelor sale azotate, care rămâne în urma sintezei. În acest caz, lanțul nemetilat suferă reparații. Ruperele catenei de ADN pot fi recunoscute și de enzimele de reparare. În organismele superioare, unde sinteza ADN-ului nu are loc continuu, ci în repliconi separate, catena de ADN nou sintetizată are rupturi, ceea ce face posibilă recunoașterea acesteia.
Restabilirea structurii ADN-ului atunci când bazele purinice ale unuia dintre lanțurile sale sunt pierdute implică detectarea defectului folosind enzima endonucleaza, care rupe legătura fosfoesterică la locul deteriorării lanțului. Apoi secțiunea modificată cu mai multe nucleotide adiacente este îndepărtată de enzima exonuclează, iar în locul ei, în conformitate cu ordinea bazelor lanțului complementar, se formează secvența corectă de nucleotide (Fig. 3.15).
Orez. 3.15. Schema de excizie, repararea ADN-ului pre-replicativ
Când una dintre bazele din lanțul ADN-ului se modifică, aproximativ 20 de enzime ADN glicozilaze iau parte la restabilirea structurii originale. Ele recunosc în mod specific daunele cauzate de deaminare, alchilare și alte transformări structurale ale bazelor. Astfel de baze modificate sunt îndepărtate. Zonele lipsite de baze apar si sunt reparate, ca si la pierderea purinelor. Dacă structura normală nu este restabilită, de exemplu în cazul dezaminării bazelor azotate, unele perechi de baze complementare sunt înlocuite cu altele - perechea C-G poate fi înlocuită cu o pereche T-A etc. (vezi secțiunea 3.4.2.3).
Formarea dimerilor de timină (T-T) în lanțurile de polinucleotide sub influența razelor UV necesită participarea enzimelor care nu recunosc bazele individuale modificate, ci o deteriorare mai extinsă a structurii ADN-ului. Procesul de reparare în acest caz este, de asemenea, asociat cu îndepărtarea regiunii care poartă dimerul și restabilirea secvenței normale de nucleotide prin sinteză pe catena de ADN complementară.
În cazul în care sistemul de reparare prin excizie nu corectează o modificare care a apărut într-o catenă de ADN, în timpul replicării această modificare este fixată și devine proprietatea ambelor catene de ADN. Acest lucru duce la înlocuirea unei perechi de nucleotide complementare cu alta sau la apariția unor rupturi (goluri) în lanțul nou sintetizat față de secțiunile modificate. Restaurarea structurii normale a ADN-ului poate avea loc și după replicare.
Reparație post-replicativă realizat prin recombinare (schimb de fragmente) între două elice duble de ADN nou formate. Un exemplu de astfel de reparare post-replicativă este refacerea structurii normale a ADN-ului atunci când dimerii de timină (T-T) apar atunci când nu sunt eliminați spontan sub influența luminii vizibile ( reparatie usoara) sau în timpul reparației excizie pre-replicative.
Legăturile covalente care apar între resturile de timină adiacente le fac incapabile să se lege de nucleotidele complementare. Ca urmare, în lanțul de ADN nou sintetizat apar rupturi (lacune), recunoscute de enzimele de reparare. Restaurarea integrității noului lanț de polinucleotide a unuia dintre ADN-ul fiică este efectuată datorită recombinării cu lanțul părinte normal corespunzător al altui ADN fiică. Golul format în lanțul mamă este apoi umplut prin sinteză pe un lanț polinucleotidic complementar acestuia (Fig. 3.16). O manifestare a unei astfel de reparații post-replicative, efectuată prin recombinare între lanțurile a două molecule de ADN fiice, poate fi considerată schimbul de material des observat între cromatidele surori (Fig. 3.17).
Orez. 3.16. Schema de reparare post-replicativă a ADN-ului:
eu- aparitia unui dimer de timina intr-unul din lanturile de ADN;
II- formarea unui „gol” în lanțul nou sintetizat împotriva secțiunii modificate a moleculei mamă după replicare (săgeata arată umplerea ulterioară a „golului” cu o secțiune din lanțul corespunzător al celei de-a doua molecule de ADN fiică);
III- restabilirea integrității lanțului fiice al moleculei superioare datorită recombinării și în molecula inferioară datorită sintezei pe lanțul complementar
Orez. 3.17. Schimburi intercromatide (indicate prin săgeți)
În timpul reparației pre-replicative și post-replicative, cea mai mare parte a daunelor aduse structurii ADN-ului este restaurată. Cu toate acestea, dacă în materialul ereditar al celulei apar prea multe leziuni și o parte din acesta nu este eliminată, sistemul de enzime de reparare inductibile (stimulate) (sistemul SOS) este activat. Aceste enzime umplu golurile, restabilind integritatea lanțurilor de polinucleotide sintetizate fără a respecta strict principiul complementarității. Acesta este motivul pentru care uneori procesele de reparare în sine pot servi ca o sursă de modificări permanente în structura ADN-ului (mutații). Această reacție se aplică și sistemului SOS.
Dacă într-o celulă, în ciuda reparației efectuate, cantitatea de deteriorare a structurii ADN-ului rămâne mare, procesele de replicare a ADN-ului în ea sunt blocate. O astfel de celulă nu se împarte, ceea ce înseamnă că nu transmite modificările rezultate descendenților săi.
Oprirea ciclului celular cauzată de deteriorarea ADN-ului, combinată cu imposibilitatea reparării moleculare a materialului ereditar alterat, poate, cu participarea unei proteine a cărei sinteză este controlată de gena p53, să conducă la activarea procesului de autodistrugere (apoptoză). ) a celulei defecte pentru a o elimina din organism.
Astfel, un set extins de diferite enzime de reparare „inspectează” continuu ADN-ul, îndepărtând zonele deteriorate din acesta și ajutând la menținerea stabilității materialului ereditar. Acțiunea combinată a enzimelor de replicare (ADN polimerază și endonuclează de editare) și a enzimelor de reparare asigură o frecvență destul de scăzută a erorilor în moleculele de ADN, care se menține la un nivel de 1 × 10 -9 perechi de nucleotide modificate per genom. Cu dimensiunea genomului uman de 3 × 10 9 perechi de nucleotide, aceasta înseamnă apariția a aproximativ 3 erori per genom care se replica. În același timp, chiar și acest nivel este suficient pentru formarea unei diversități genetice semnificative sub formă de mutații genetice în timpul existenței vieții pe Pământ.
Orez. 3.14. Schema procesului de corecție în timpul sintezei ADN:
I-includerea în lanțul ADN a unei nucleotide cu o formă alterată (tautomeră) de citoeină, care se asociază „ilegal” cu adenina; II - trecerea rapidă a citozinei la forma sa normală perturbă împerecherea acesteia cu adenina; capătul 3"-OH nepereche al lanțului sintetizat împiedică alungirea lui ulterioară sub acțiunea ADN polimerazei; III - ADN polimeraza îndepărtează nucleotida ilegală, în urma căreia capătul 3"-OH împerecheat cu matricea reapare; IV - ADN polimeraza continuă extensia lanțului la capătul 3"-OH
Restaurarea structurii originale a ADN-ului necesită participarea unui număr de enzime. Un punct important în declanșarea mecanismului de reparare este detectarea unei erori în structura ADN-ului. Adesea, astfel de erori apar în lanțul nou sintetizat în timpul procesului de replicare. Enzimele de reparare trebuie să detecteze acest lanț special. La multe specii de organisme vii, catena de ADN nou sintetizată diferă de cea maternă prin gradul de metilare a bazelor sale azotate, care rămâne în urma sintezei. În acest caz, lanțul nemetilat suferă reparații. Ruperele catenei de ADN pot fi recunoscute și de enzimele de reparare. În organismele superioare, unde sinteza ADN-ului nu are loc continuu, ci în repliconi separate, catena de ADN nou sintetizată are rupturi, ceea ce face posibilă recunoașterea acesteia.
Restabilirea structurii ADN-ului atunci când bazele purinice ale unuia dintre lanțurile sale sunt pierdute implică detectarea defectului folosind enzima endonucleaza, care rupe legătura fosfoesterică la locul deteriorării lanțului. Apoi secțiunea modificată cu mai multe nucleotide adiacente este îndepărtată de enzima exonuclează, iar în locul ei, în conformitate cu ordinea bazelor lanțului complementar, se formează secvența corectă de nucleotide (Fig. 3.15).
Orez. 3.15. Schema de excizie, repararea ADN-ului pre-replicativ
Când una dintre bazele din lanțul ADN-ului se modifică, aproximativ 20 de enzime ADN glicozilaze iau parte la restabilirea structurii originale. Ele recunosc în mod specific daunele cauzate de deaminare, alchilare și alte transformări structurale ale bazelor. Astfel de baze modificate sunt îndepărtate. Zonele lipsite de baze apar si sunt reparate, ca si la pierderea purinelor. Dacă structura normală nu este restabilită, de exemplu în cazul dezaminării bazelor azotate, unele perechi de baze complementare sunt înlocuite cu altele - perechea C-G poate fi înlocuită cu o pereche T-A etc. (vezi secțiunea 3.4.2.3).
Formarea dimerilor de timină (T-T) în lanțurile de polinucleotide sub influența razelor UV necesită participarea enzimelor care nu recunosc bazele individuale modificate, ci o deteriorare mai extinsă a structurii ADN-ului. Procesul de reparare în acest caz este, de asemenea, asociat cu îndepărtarea regiunii care poartă dimerul și restabilirea secvenței normale de nucleotide prin sinteză pe catena de ADN complementară.
În cazul în care sistemul de reparare prin excizie nu corectează o modificare care a apărut într-o catenă de ADN, în timpul replicării această modificare este fixată și devine proprietatea ambelor catene de ADN. Acest lucru duce la înlocuirea unei perechi de nucleotide complementare cu alta sau la apariția unor rupturi (goluri) în lanțul nou sintetizat față de secțiunile modificate. Restaurarea structurii normale a ADN-ului poate avea loc și după replicare.
Reparația post-replicativă este efectuată prin recombinare (schimb de fragmente) între două elice duble ADN nou formate. Un exemplu de astfel de reparare post-replicativă este refacerea structurii normale a ADN-ului atunci când apar dimeri de timină (T-T), când aceștia nu sunt eliminați spontan sub influența luminii vizibile (repararea luminii) sau în timpul reparației exciziei pre-replicative.
Legăturile covalente care apar între resturile de timină adiacente le fac incapabile să se lege de nucleotidele complementare. Ca urmare, în lanțul de ADN nou sintetizat apar rupturi (lacune), recunoscute de enzimele de reparare. Restaurarea integrității noului lanț de polinucleotide a unuia dintre ADN-ul fiică este efectuată datorită recombinării cu lanțul părinte normal corespunzător al altui ADN fiică. Golul format în lanțul mamă este apoi umplut prin sinteză pe un lanț polinucleotidic complementar acestuia (Fig. 3.16). O manifestare a unei astfel de reparații post-replicative, efectuată prin recombinare între lanțurile a două molecule de ADN fiice, poate fi considerată schimbul de material des observat între cromatidele surori (Fig. 3.17).
Orez. 3.16. Schema de reparare post-replicativă a ADN-ului:
I - apariția unui dimer de timină într-unul dintre lanțurile ADN;
II - formarea unui „gol” în lanțul nou sintetizat împotriva secțiunii modificate a moleculei mamă după replicare (săgeata arată umplerea ulterioară a „golului” cu o secțiune din lanțul corespunzător al celei de-a doua molecule de ADN fiică);
III - restabilirea integrității catenei fiice a moleculei superioare datorită recombinării și a moleculei inferioare datorită sintezei pe lanțul complementar
Orez. 3.17. Schimburi intercromatide (indicate prin săgeți)
În timpul reparației pre-replicative și post-replicative, cea mai mare parte a daunelor aduse structurii ADN-ului este restaurată. Cu toate acestea, dacă în materialul ereditar al celulei apar prea multe leziuni și o parte din acesta nu este eliminată, sistemul de enzime de reparare inductibile (stimulate) (sistemul SOS) este activat. Aceste enzime umplu golurile, restabilind integritatea lanțurilor de polinucleotide sintetizate fără a respecta strict principiul complementarității. Acesta este motivul pentru care uneori procesele de reparare în sine pot servi ca o sursă de modificări permanente în structura ADN-ului (mutații). Această reacție se aplică și sistemului SOS.
